通常情况当细胞经过 30 次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过 95％ 的细胞保持有活力，且倍增时间小于 30 小时，细胞仍然可以使用。如果活力下降和倍增时间延长，它们的感染力将不再有效。

为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为 10 单位/毫升细胞悬液。

 我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通

过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要

的情况下，才使用胰酶消化细胞。

   胰酶消化一个 T25 瓶的 sf9 细胞：

   1. 去除培养基。

   2. 用 2 ml PBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除 PBS。

   3. 加入 2mL 0.25 % 的胰酶 EDTA（恰好覆盖细胞表面）。

   4. 37 ℃ 孵育 5 到 10 分钟。

   5. 向细胞中加入 2 ml 完全培养液，移入锥形管，用 2mL 培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的 FBS 终止了胰酶的活性。）

   6. 离心（1100 rpm）沉淀细胞。去除培养基。

   7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是 L-酪氨酸或者 L-胱氨酸的沉淀。一般升高温度，沉淀就可以溶解。这些昆虫培养基中谷氨酰胺的浓度比经典培养基中氨基酸的浓度（2 mM） 高 6 倍，酪氨酸、胱氨酸的浓度比在 RPMI 1640 中高数十倍，一旦析出便很难溶解。当然沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 

3.0 × 10⁶ cells/mL。

High Five 细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

生长培养基的 pH 值对细胞的增殖和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在 pH 值 6.0～6.4 范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380 mOsm/kg。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持 pH 值和渗透压在以上所列的范围之内。 

缓冲液的 pH 值随温度变化而变化。下表列出了 50 mM Tris-HCl 溶液在 4 ℃，25 ℃，37 ℃时，不同的 pH 值。

对于普通使用的缓冲液，pH 值随温度变化而变化。

下表列出温度改变 10 ℃时，pH 值的变化情况：

例如 20 ℃下配制pH7.4 Tris缓冲液，40 ℃时pH值为 7.4 -（2 × 0.310）＝ 6.78

缓冲系统 pKa/20 ℃ ΔpKa/10 ℃

Mes        6.15-0.110

Ada        6.60-0.110

Pipes      6.80-0.085

Aces       6.90-0.200

Bes        7.15-0.160

Mops      7.20-0.013

Tes                 7.50-0.200

Hepes              7.55-0.140

Tricine             8.15-0.210

Tris                8.30-0.310

Bicine              8.35-0.180

Glycylglycine        8.40-0.280

二价离子能抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便减少二价离子对胰蛋白酶活性的影响。建议胰蛋白酶处理细胞前，用不含钙镁离子的 PBS 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。